1 菌落总数及测定

◆菌落是指细菌在固体培养基上生长繁殖而形成的能被肉眼识别的生长物,它是由数以万计相同的细菌集合而成。当样品被稀释到一定程度,与培养基混合,在一定培养条件下,每个能够生长繁殖的细菌细胞都可以在平板上形成一个可见的菌落。 

◆菌落总数就是指食品检样经过处理,在一定条件下(如需氧性质、培养基成分、pH、培养温度和时间等) 1 mL ( g)检样中所含菌落的总数。 

◆菌落总数测定是用来判定食品被细菌污染的程度、食品的新鲜度及卫生质量,它反映食品在生产、加工、销售过程中是否符合卫生要求,以便对被检样品做出适当的卫生学评价。也可以应用这一方法观察食品中细菌的性质以及细菌在食品中繁殖的动态,菌落总数的多少在一定程度上标志着食品卫生质量的优劣 。

2 菌落总数测定中的注意事项

2.  1 所用器皿及稀释液 

 ●检验中所用玻璃器皿,如培养皿,吸管、试管、移液器的吸头等必须是完全灭菌的,并在灭菌前彻底洗涤干净,不得残留有抑菌物质。 

● 用作样品稀释的液体,每批都要有空白对照。如果在琼脂对照平板上出现几个菌落时,要查找原因,如可通过追加对照平板,以判定是空白稀释液,用于倾注平皿的培养基,还是平皿、吸管或空气可能存在的污染。

●检样的稀释液一般用灭菌盐水,如果对含盐量较高的食品(如酱品等)进行稀释,则宜用蒸馏水。做醋时用20% ～ 30%碳酸钠调pH 至中性。 

 2.2 检样的稀释 

●检样稀释时,应以无菌操作称取(或量取)有代表性的样品25 g (或mL ) , 剪碎放于含有225 mL灭菌稀释液的玻璃瓶内(瓶内预置适当数量的玻璃珠) ,经充分振摇作成1: 10 的稀释液。如系肉、鱼等固体样品,先用自来水把表面冲洗干净,取可食部分(即鱼肉)剪细加入稀释液后,置均质器中以8 000 ～ 10 000 r /min 速度处理1 min,使做成均匀的1: 10稀释液。 

 ●根据食品卫生标准要求或对标本污染情况的估计,将上述1: 10的检样稀释液再做成几个适当的10 倍递增稀释液,每递增稀释一次,必须另换1 支1 mL 灭菌吸管或吸头,这样所得检样的稀释倍数方为准确。 

●从吸管筒内取出灭菌吸管时,不要将吸管尖端触及其他仍留在容器内的吸管的外露部分;而且吸管在进出装有稀释液的玻璃瓶和试管时,也不要触及瓶口及试管口的外侧部分;因为这些部分都可能接触过手或其他沾污物。当用吸管将检样稀释液加至另一装有9 mL稀释液的试管内时,应小心沿管壁加入,不要触及管内稀释液,以防吸管尖端外侧部分黏附的检液也混入其中。 

●对吸管体积的要求是取1 mL的样品匀液使用的吸管的最小刻度应该不低于0. 1 mL。

2. 3 平板接种与培养 

●在作10倍递增稀释的同时,即以吸取该稀释度的吸管移lmL稀释液加入皿内(从皿侧加入,不要揭去皿盖) ,最后将吸管直立使液体流毕,并在皿底干燥处再擦一下吸管尖将余液排出,而不要吹出。每个稀释度应作2 个平皿。 

● 用于倾注平皿的营养琼脂应预先加热使其融化,并保温于( 45 ±1) ℃恒温水浴中待用。温度太高影响细菌生长,太低琼脂易凝固不能与检液充分混匀, 倾注平皿时, 每皿内倾入约15 mL,平板过厚可影响观察,太薄又易干裂,最后将琼脂底部带有沉淀的部分弃去。

※为了防止细菌增殖及产生片状菌落,在检液加入平皿后,应尽 快倾注培养基并旋转混匀,可正反两个方向旋转,检样从开始稀释到倾注最后一个平皿所用时间不宜超过20 min。琼脂凝固后,在数分钟内即应将平皿翻转予以培养,这样可避免菌落蔓延生长。

●为了控制污染,需做空白对照实验,在取样进行检验的同时,于工作台上打开一块琼脂平板,其暴露的时间,应与该检样从制备、稀释到加入平皿时所暴露的最长的时间相当,然后与加有检样的平皿一并置于温箱内培养,以了解检样在检验操作过程中有无受到来自空气的污染。 

●培养温度,应根据食品种类而定。一般用36 ℃培养,培养温度和时间有不同的区分,是因为在制定这些食品卫生标准中关于菌落总数的规定时,分别采用了不同的温度和培养时间所取得的数据,同时水产品因来自淡水或海水,水的温度较低,因而制定水产品细菌方面的卫生标准时,系用30 ℃作为培养的温度 。 

● 加入平皿内的检样稀释液(特别是10- 1的稀释液) ,有时带有食品颗粒,在这种情况下,为了避免与细菌菌落发生混淆,可作一检样稀释液与琼脂混和的平皿,不经培养,而于4 ℃环境中放置,以便在计数检样菌落时用作对照。

2.  4 菌落记数与报告 

● 到达规定培养时间,应立即计数。如果不能立即计数,应将平板放置于0～4 ℃,但不得超过24 h。从温箱内取出平皿进行菌落计数时,应先分别观察同一稀释度的两个平皿和不同稀释度的几个平皿内平板上菌落生长情况。

平行试验的2 个平板与菌落数应该接近,不同稀释度的几个平板上菌落数则应与检样稀释倍数成反比,即检样稀释倍数越大,菌落数越低,稀释倍数越小,菌落数越高。如果稀释度大的平板上菌落数反比稀释度小的平板上菌落数高,则系检验工作中发生的差错,属实验室事故。此外,也可能因抑菌剂混入样品中所致,均不可用作检样计数报告的依据。 

●如果平板上出现链状菌落,菌落之间没有明显的界限,这是在琼脂与检样混合时,一个细菌块被分散所造成。一条链作为一个菌落计不要把链上生长的各个菌落分开来数。 

●检样如系微生物类制剂(如酸牛乳、酵母制酸性饮料) ,则平板计数中应相应地将有关微生物(乳酸杆菌、酵母菌)排除,不可并入检样的菌落总数内作报告。一般在校正检样的pH 7. 6后,再进行稀释和培养,此类嗜酸性微生物往往即不易生长。

●当检样的菌落数为1～100 时,按实有数报告;大于100时,只记录左面头两位数字(用两位有效数字作报告,可避免产生虚假的精确概念) ,左面第三位数字则用四舍五入法计算,从第二位数字之后都记为0,为了缩短数字后面的0数,也可用10 的指数来表示,固体检样以克( g)为单位报告,液体检样以毫升(mL)为单位报告,表面涂擦则以平方厘米( cm2 )报告。

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